內(nèi)蒙古嘧啶磺胺嘧啶人工抗體和單鏈抗體的制備及特性研究~

食品和生態(tài)環(huán)境中的磺胺類藥物殘留,不僅危害人類鍵康,而且造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,越來越受到人們的關(guān)注。建立磺胺嘧啶的快速、準(zhǔn)確檢測方法對食品安全,人類健康以及打破發(fā)達(dá)國家技術(shù)壁壘具有重要意義。論文針對這一急需解決的重要問題,制備了磺胺嘧啶人工抗體(Artificial antibody),建立了分子印跡柱-高效液相色譜法檢測食品樣品中磺胺嘧啶殘留的方法。同時進(jìn)行了磺胺嘧啶單鏈抗體(Single-chain variable fragment, scFv)的研究,構(gòu)建了單鏈抗體隨機(jī)突變文庫,以期從分子水平探討更新、更快速準(zhǔn)確的方法。主要研究結(jié)果如下： 1.采用紫外吸收光譜法和HNMR實驗的方法研究了磺胺嘧啶模板分子和丙烯酰胺功能單體之間的相互作用。內(nèi)蒙古玉嘧磺胺結(jié)果表明,磺胺嘧啶和丙烯酰胺分子間會形成氫鍵作用,并隨著磺胺嘧啶濃度的增加,丙烯酰胺混合液的紫外吸收會發(fā)生紅移現(xiàn)象且吸收峰的強(qiáng)度減弱。 2.采用本體聚合法制備了磺胺嘧啶分子印跡聚合物,并采掃描電子顯微鏡法、傅立葉變換紅外光譜分析法、Brunauer-Emmett-Teller實驗方法、內(nèi)蒙古嘧啶及吸附動力學(xué)實驗等方法研究磺胺嘧啶分子印跡聚合物的特性。結(jié)果表明,MIP表面含有大量模板分子被洗脫后所留下的立體空穴,MIP的比表面積為182.2m2g-1,MIP的吸附容量為7.8mg/g。 3.采用單因素實驗方法優(yōu)化磺胺嘧啶分子印跡柱的固相萃取條件。結(jié)果表明,在2.5%乙腈-水溶液(v/v)為萃取液,流速為2mL/min,40%乙腈-水溶液(v/v)為洗脫液,洗脫體積為3mL的條件下,磺胺嘧啶分子印跡柱的萃取效率為99%。 4.建立了分子印跡柱-高效液相色譜檢測豬肉中磺胺嘧啶殘量的方法。結(jié)果表明,在固相萃取條件下,豬肉樣品中磺胺嘧啶的濃度在50-4000μg／kg范圍內(nèi),檢測線性關(guān)系良好,線性回歸方程為y=0.063x+0.0294,(R2=0.9998,n=3),定量限為33.3μg/kg,檢出限為10μg/kg,加標(biāo)回收率≥75.6%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤6.1%。 5.采用RT-PCR技術(shù)與SOE-PCR技術(shù)構(gòu)建了磺胺嘧啶單鏈抗體的基因,并采用生物信息學(xué)方法分析磺胺嘧啶單鏈抗體的結(jié)構(gòu)特性。結(jié)果表明,磺胺嘧啶單鏈抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)均含有鼠源的3個CDR區(qū)和4個FR區(qū)；NCBI DNA Blast未見相同序列,但重鏈可變區(qū)基因與鼠源的IGHV1-14*01的同源率達(dá)83.7%,輕鏈可變區(qū)基因與鼠源的IGKV6-20*01同源率達(dá)91.6%；單鏈抗體氨基酸序列提交至ExPASy分析可知,單鏈抗體的分子量為26582.4,分子式為C1174H1779N3130376S9,等電點為7.6,親水性指數(shù)為-0.484,不穩(wěn)定系數(shù)為49.38,該單鏈抗體屬于不穩(wěn)定蛋白。 6.采用分子生物技術(shù)與基因克隆技術(shù)構(gòu)建了磺胺嘧啶單鏈抗體的原核表達(dá)載體pET22b-SD,并將其轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中,采用單因素實驗方法優(yōu)化了重組菌株E.coli BL21(DE3)的表達(dá)條件。內(nèi)蒙古嘧啶結(jié)果表明,重組菌株E.coli BL21(DE3)以包涵體形式表達(dá)了磺胺嘧啶單鏈抗體；誘導(dǎo)表達(dá)的條件為誘導(dǎo)溫度為30℃、IPTG誘導(dǎo)濃度為300μM、內(nèi)蒙古氨基嘧啶起始pH7、裝料系數(shù)為30%和誘導(dǎo)時間為8h；蛋白印跡和酶聯(lián)免疫吸附實驗表明磺胺嘧啶單鏈抗體具有生物活性。 7.采用基因克隆技術(shù)將磺胺嘧啶單鏈抗體基因克隆至分泌型pPIC9K表達(dá)載體中,并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115。結(jié)果表明,MM平板和MD平板篩選獲得Muts型畢赤酵母GS115重組子,含G418抗生素的YPD平板篩選獲得多拷貝畢赤酵母GS115重組子；在甲醇誘導(dǎo)下,多拷貝畢赤酵母GS115重組子表達(dá)了磺胺嘧啶單鏈抗體。 8.采用易錯PCR技術(shù)構(gòu)建了磺胺嘧啶單鏈抗體隨機(jī)突變噬菌體文庫。結(jié)果表明,在Mg2+濃度為7mmol/L, dATP和dGTP的濃度分別為0.2mmol/L, dCTP和dTTP的濃度分別為1mmol/L, Mn2+濃度為0.3mmol/L易錯PCR條件下,基因突變率為1.3%,內(nèi)蒙古嘧啶突變具有一定程度的A／T偏向性；噬菌體文庫庫容為1.26×106。