青海湖嗜鹽菌多樣性與四氫嘧啶的生物合成機制研究：

青海湖是我國境內(nèi)最大的內(nèi)陸咸水湖,地處青藏高原東北隅,海拔3194m、面積4282.3km2,是國家自然保護區(qū),被國際重要濕地名錄收錄。內(nèi)蒙古嘧啶青海湖是青藏高原(Qinghai-Tibet Plateau)生物多樣性最豐富的寶庫之一,水體與土壤中棲息有嗜鹽、嗜冷和嗜堿等多種環(huán)境微生物,并且這些微生物具有典型的生理生化特點和特殊環(huán)境適應性。嗜鹽微生物(Halophiles)是一類新型的極端環(huán)境微生物(Extremophiles)、因其應用廣泛而頗受關(guān)注,如在嗜鹽機理、嗜鹽菌素(Halocin)、相溶物質(zhì)(Compatible solute)、細菌視紫紅質(zhì)(Bacteriorhodopsin)等基礎(chǔ)研究；如在精細化工、環(huán)境生物治理、生物電子和醫(yī)藥工業(yè)等應用研究方面。鑒于高原地區(qū)生態(tài)環(huán)境的優(yōu)勢,針對青海湖嗜鹽菌的生長特性、種群多樣性、系統(tǒng)進化和相容溶質(zhì)四氫嘧啶(Ectoine)合成機制的相關(guān)研究,具有重要的基礎(chǔ)研究意義。同時,了解與掌握區(qū)域微生物的種群多樣性,對于制定地區(qū)的自然保育政策,以及開展生物多樣性保護與生物自然資源的應用開發(fā),提供重要的參考依據(jù)。 內(nèi)蒙古嘧啶本論文系統(tǒng)綜述了嗜鹽細菌的生存環(huán)境、基本分類以及滲透壓調(diào)節(jié)機制的研究現(xiàn)狀,并重點討論四氫嘧啶生物合成與分解代謝、合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制、內(nèi)蒙古玉嘧磺胺工業(yè)化生產(chǎn)菌株以及過量化生產(chǎn)策略的研究進展。通過分析青海湖嗜鹽細菌的存在現(xiàn)狀、生長優(yōu)勢種群、胞內(nèi)四氫嘧啶的積聚與影響因素,以及解析四氫嘧啶生物合成ect操縱子的結(jié)構(gòu)特征與調(diào)節(jié)模式等初步研究,獲得了以下主要成果： 1)本研究首次從青海湖水體中分離篩選嗜鹽菌種資源,分析青海湖可培養(yǎng)嗜鹽菌的種群多樣性。利用OSM培養(yǎng)基(Oesterhelt-Stoeckenius medium)獲得了35株青海湖嗜鹽菌種質(zhì)資源,并構(gòu)建了青海湖嗜鹽菌的種群系統(tǒng)發(fā)育樹和確定其進化定位。青海湖嗜鹽菌以中度嗜鹽菌為主,約占62.9%；輕度嗜鹽菌次之,約占22.9%；耐鹽菌與非嗜鹽菌分別占11.4%和2.9%。根據(jù)16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育,分析表明：Y-變形菌綱(y-Proteobacteria)菌株最多,約占68.6%；芽孢桿菌綱(Bacilli)次之,約占17.1%；放線菌綱(A ctinobacteridae)、α-變形菌綱(a-Proteobacteria)和散囊菌亞綱(Eurotiomycetidae)的類群才¨對較少。這些嗜鹽菌分屬于14個屬,其中以海洋螺菌目鹽單胞菌屬(Halomonas)為優(yōu)勢種群,共計10株。Halomonas作為嗜鹽機理與相溶物質(zhì)Ectoine工業(yè)生產(chǎn)的模式生物,已被廣泛應用?；?6SrRNA序列同源性分析、16S-23S rRNAISR-RFLP分析和菌體總蛋白SDS-PAGE譜帶比較,我們初步認定10株青海湖鹽單胞菌可分為7個種進化分支單元,存在潛在的新種。內(nèi)蒙古嘧啶 2)以優(yōu)勢中度嗜鹽菌為材料,研究了相容溶質(zhì)四氫嘧啶的積聚量與積聚影響條件。采用80%乙醇法抽提胞內(nèi)四氫嘧啶,HPLC分析表明：大多數(shù)青海湖中度嗜鹽菌胞內(nèi)積聚四氫嘧啶,并初步獲得5株具有四氫嘧啶高產(chǎn)潛力的野生菌株。以青海湖H. ventosae QHL5為材料,在Na+、K+、Mg2+、pH和溫度等不同因素的影響作用下,利用HPLC分析QHL5胞內(nèi)的四氫嘧啶生物積聚量。在優(yōu)化條件下,QHL5積聚四氫嘧啶的最大濃度為379.6士8.26mg/L,達到167.1士3.64mg/g細胞干重。 3)利用染色體步移技術(shù),成功地克隆并表達四氫嘧啶的合成ectABC基因簇,構(gòu)建了青海湖優(yōu)勢嗜鹽菌四氫嘧啶合成基因簇物理圖譜。青海湖鹽單胞菌Halomonas sp. QHL1的ectABC操縱子全長序列3580bp,結(jié)構(gòu)基因ectA(579bp)、 內(nèi)蒙古氨基嘧啶ectB(1269bp)與ectC(390bp)串聯(lián)排列,ectA與ectB間隔109bp, ectB與ectC間隔91bp, ectA上游調(diào)控序列635bp。基于生物信息學預測分析知：兩個啟動子(67o與838因子控制)和若干未知功能的保守模序存在于QHL1的ect操縱子上游。 4)利用分子克隆技術(shù),構(gòu)建了四氫嘧啶異源生物合成工程菌株(以Kcoli為宿主)。成功實現(xiàn)了ectA、ectB與ectC基因的異源表達,并構(gòu)建了重組ectABC基因工程菌(Kcoli BL21/pET-28a (+)-ectABC),分析了耐鹽能力。重組ectABC基因工程菌與對照Kcoli BL21相比,具有較高的鹽耐受能力,但胞內(nèi)四氫嘧啶合成量卻偏低,尚需深入研究。內(nèi)蒙古嘧啶重組嗜鹽工程菌的耐鹽能力和四氫嘧啶合成量的研究,為后續(xù)的開發(fā)和利用奠定了良好的基礎(chǔ),并提供了一定的技術(shù)支持。