內(nèi)蒙古嘧啶胺針對(duì)不可逆的嘧啶類EGFR酪氨酸激酶抑制劑的EGFR突變和耐藥

內(nèi)蒙古嘧啶胺目的：包括WZ4002，CO-1686和AZD9291在內(nèi)的針對(duì)特定突變類型，不可逆的第三代EGFR-TKI對(duì)于發(fā)生吉非替尼/厄洛替尼耐藥突變T790M的肺癌患者及臨床前模型中是有效的。但是，目前關(guān)于腫瘤對(duì)于這類EGFR酪氨酸激酶抑制劑的獲得性耐藥進(jìn)展的研究很少。為此，我們嘗試探尋研究和找出針對(duì)此類第三代EGFR-TKI的EGFR突變。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：我們進(jìn)行了針對(duì)EGFR突變（單獨(dú)敏感突變或伴隨T790M突變）的Ba/F3細(xì)胞的亞硝基乙基脲（NEU）誘變篩選并選擇出耐藥的克隆。我們?cè)u(píng)估了EGFR-TKI在伴隨耐藥突變的EGFR突變模型中的敏感性。

結(jié)論：我們發(fā)現(xiàn)了3種主要的藥物耐藥突變，EGFR L718Q，L844V和C797S突變都導(dǎo)致對(duì)WZ4002和CO-1686的耐藥。相比之下，只有C797S突變作用于AZD9291的耐藥機(jī)制。產(chǎn)生L718突變，L844V突變或C797S突變同時(shí)伴隨EGFR敏感突變（如19外顯子缺失或L858R突變）的細(xì)胞對(duì)于一代EGFR-TKI吉非替尼和厄洛替尼仍然敏感。存在19缺失/L858R加上T790M以及C797S突變的情況下對(duì)目前所有EGFR-TKI耐藥，但是L858R/T790M/C797S仍保留對(duì)Cetuximab的部分敏感。 

總結(jié)：我們的發(fā)現(xiàn)提供了針對(duì)第三代EGFR-TKI耐藥機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并鑒定出對(duì)現(xiàn)有臨床EGFR-TKI仍然有效的特定基因組合。這些研究也許會(huì)對(duì)未來EGFR-TKI治療新策略的發(fā)展提供指導(dǎo)。

內(nèi)蒙古嘧啶胺轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)相關(guān)性：進(jìn)行EGFR-TKI治療后，常見的獲得性耐藥的發(fā)生機(jī)制是T790M突變的出現(xiàn)。目前對(duì)此的治療策略包括嘧啶類針對(duì)特定突變的EGFR抑制劑，至今為止這些藥物可以使大部分由于發(fā)生T790M突變導(dǎo)致耐藥的肺癌患者腫瘤縮小。通過體外模擬藥物耐藥過程，我們發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致針對(duì)化合物WZ4002以及臨床化合物AZD9291和CO-1686發(fā)生相關(guān)耐藥的EGFR突變。這些發(fā)現(xiàn)也許會(huì)幫助預(yù)測(cè)可能在臨床中出現(xiàn)的獲得性耐藥機(jī)制，以及用于潛在的以后可以在臨床中應(yīng)用的治療策略研究。

鑒定出新的藥物耐藥位點(diǎn)：為了找出可能導(dǎo)致對(duì)WZ4002產(chǎn)生耐藥的突變位點(diǎn), 我們使用了先前提到過的ENU誘導(dǎo)突變篩選法。將攜帶常見EGFR敏感突變（L858R and Del E746_A750）或伴隨T790M突變的Ba/F3細(xì)胞，在進(jìn)行100 nmol/L或1 mmol/L濃度的WZ4002中進(jìn)行ENU處理2周后選擇出耐藥的克隆。在四中不同的細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)了三種突變：

L718Q (codon 2153, T>A), L844V (codon 2530, C>G), 和C797S (codon 2389, T>A) 

C797位點(diǎn)是和WZ4002共價(jià)結(jié)合的位點(diǎn)。若發(fā)生突變，則會(huì)導(dǎo)致藥物耐藥。L844V突變先前已經(jīng)在一位非小細(xì)胞肺癌患者上被觀察到。 位于L718位點(diǎn)的L718P，L718V和L718M突變先前已被發(fā)現(xiàn)，但是EGFR L718Q并未發(fā)現(xiàn)過。這些突變目前的臨床意義還未明確。 我們接下來也驗(yàn)證了是否L718Q 和 L844V突變是致癌性的突變并且導(dǎo)致了耐藥，抑或只是后者。T790M突變既是致癌突變同時(shí)又引起了對(duì)藥物的耐藥。 而EGFR L718Q 和 L844V 都不足以導(dǎo)致 IL3-獨(dú)立細(xì)胞在EGFR野生型背景的生長(zhǎng)（圖1B）。有意思的是，雖然這些突變導(dǎo)致對(duì)WZ4002的耐藥，但是他們對(duì)不可逆的喹唑啉基EGFR抑制劑阿法替尼、neratinib和CL-387、785仍然敏感（如圖1C）。通過抑制EGFR磷酸化導(dǎo)致對(duì)這些Ba/F3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。吉非替尼作為一種可逆的喹唑啉基EGFR TKI，在L844V模型中有更好的療效 （圖1C）。但我們沒能在Del E746_A750 Ba/F3細(xì)胞中使用ENU誘導(dǎo)篩選方法鑒定出二重突變(圖1A)。處理過的EGFR Del E746_A750/L718Q而不是EGFR L858R/L718Q的Ba/F3細(xì)胞展示了一種生長(zhǎng)劣勢(shì)，從而解釋了為什么這類突變沒有在以前的方法中被發(fā)現(xiàn)（圖1D）。內(nèi)蒙古嘧啶胺在出現(xiàn)L718Q突變后，EGFR Del E746_A750細(xì)胞的EGFR磷酸化被抑制也支持了這個(gè)觀點(diǎn)。